概述

CRISPR-Cas9系统是基因编辑的有力工具，通过设计不同序列的向导RNA靶向目标DNA序列，几乎能够对任意基因进行编辑。由于靶向灵活，编辑效率高，操作简便等特点，自发现以来被广泛应用于基因功能研究，基因工程和生物医药领域。

相较于对单个基因组位点进行编辑，sgRNA文库通常包含数千至数十万个不同的sgRNA。在CRISPR筛选实验中，将这个文库转染到目标细胞后，通过表型筛选，再结合NGS分析，可以成功筛选出目标基因。sgRNA文库的优点在于，它可以根据实验需求，对特定类别的基因或全基因组进行序列设计，这一特点使其成为一种不受序列、细胞或物种限制的高通量基因功能研究工具。

sgRNA文库进行筛选实验流程图

应用领域

● 功能基因组学研究：利用sgRNA文库，可以对大规模基因进行敲除和功能筛选，深入探究基因功能和相互作用。

● 基因敲除研究：通过sgRNA文库中的序列，可以针对特定基因或基因家族进行敲除研究，以了解其在细胞生长、分化、代谢等方面的作用。

● 表型筛选：利用sgRNA文库，可以快速筛选出与某些疾病表型及性状相关的基因，为疾病诊断和治疗提供依据。

● 药物研发：通过sgRNA文库，可以筛选出药物作用的靶点，为新药研发提供候选靶点。

● 基因组编辑：sgRNA文库可以用于基因组的编辑和修饰，为基因治疗和遗传疾病的干预提供技术支持。

迪赢sgRNA定制文库

一旦确定了目标基因和相应的sgRNA序列，迪赢通过自主研发的高通量合成平台合成定制的寡核苷酸池。此后，寡核苷酸经过扩增，可以有效地克隆到适当的慢病毒表达载体骨架中。所得的质粒库可以包装成慢病毒颗粒，用于在任何选择的细胞系中进行基因筛选。

文库构建包括序列合成，扩增及序列克隆到质粒。交付质粒可直接用于病毒包装。

服务特色

● 文库高质

文库覆盖率>99.5%，分布斜率Skew Ratio <10。

● 性价比高

自主研发的高通量合成平台，精准合成寡核苷酸池，成本更低。

● 稳定性好

工艺稳定，质粒交付量可达微克级。

● 快速交付

交付周期可低至4周。

交付内容

● 文库菌液及抽提质粒。

● 100个克隆的桑格测序结果，空载率<10%，完全正确率＞70%。

● NGS文库质检结果报告，覆盖率>99.5%，分布斜率Skew Ratio <10。

数据

构建一个包含靶向人全基因组的sgRNA文库，文库包含63950 条sgRNA序列。文库构建完成后Sanger及NGS检测文库错误率，覆盖度及均一性。

文库错误率低

选取一个批次构建完成后随机抽取30个克隆进行桑格测序。测序结果表明在随机挑选的克隆中，100%的sgRNA序列和理论序列完全一致。

图1. 桑格测序结果

覆盖率高、分布均一，批次间稳定性高

文库的覆盖度和分布均一性是评价文库质量的重要指标，使用NGS方法进行验证。覆盖率是指构建文库中包含目标序列的比例。理想状态下文库中不同sgRNA是均匀分布的，但因PCR过程及克隆过程会有一定的偏好性，导致一部分sgRNA reads数较低，一部分sgRNA reads数较高，因此使用均一性评价文库中序列分布的均匀程度，通常采用分布斜率Skew Ratio评价，通常认为数值<10代表为合格文库，数值越小代表均一性越好。

四个批次构建文库数据分析结果如下：

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