1.产品简介：Ni Seplife® FF（NTA）是蓝晓科技自主研发的一种新型亲和层析介质，是将氨基三乙酸基 键合在高流速琼脂糖凝胶过滤层析介质上，再螯合金属离子 Ni2+形成的一种亲和层析介质，其 利用样品组分中的组氨酸与金属离子的亲和吸附进行分离纯化。镍螯合高流速琼脂糖层析介质 （NTA）特异性好，流速快，螯合金属离子更稳定不易脱落，能耐受更高的还原剂，物理和化 学性能稳定，批次重复性好，颗粒粒度均匀，分离效果好。可用于分离纯化能被金属离子吸附 的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白及带 His 标签的重组蛋白。

2.使用方法

3.1 装柱 装柱按照标准操作规程操作。必须保证每种材料都处于工作温度，凝胶装柱前需要脱气。

3.2 平衡 用 2~5个柱床体积的初始缓冲溶液进行平衡，直至电导率、pH值等参数不变。 

3.3 上样 （1）样品一般溶解于 pH6～8的初始缓冲液中，提高上样缓冲液的 pH值可以增大载量。（2）缓冲液中不能含有 EDTA和柠檬酸盐，同时最好避免巯基乙醇、DTT等还原剂。 （3）常用缓冲液有 10～100mmol/L磷酸钠缓冲液、20～200mmol/LTris-HCl缓冲液等。 （4）缓冲液中一般要加入 0.15～0.5mol/L的 NaCl以消除离子交换作用。 （5）初次使用镍螯合琼脂糖凝胶时，推荐使用 50mmol/L PBS（50 mmol/L NaH2PO4，0.5 mol/L NaCl，pH 7.4）作为初始缓冲液。

3.4 洗脱 洗脱一般分为以下几种方法： （1）降低 pH洗脱：大多数蛋白在 pH 6～4会被洗脱下来（也可以在 pH 3～4），缓冲液 可以是醋酸钠、柠檬酸和磷酸盐缓冲体系。 （2）竞争性洗脱：线性增加或一步增加同金属离子有亲和力的竞争物质的浓度（如 0～ 0.5mol/L咪唑、0～50 mmol/L组氨酸、0～2mol/L NH4Cl）。 （3）螯合剂洗脱：EDTA、EGTA 等螯合剂可同金属离子产生作用力会使蛋白被洗脱下来。 但是此法不能分离不同的蛋白，会影响蛋白的吸附，导致融合蛋白无法挂柱。 

备注：（1）初次使用时，如不确定洗脱需要的咪唑浓度，推荐在初始缓冲液中分别加入 10mmol/L、20mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、500mmol/L咪唑，浓度从低到高分别洗脱和收集重组蛋白，之后通过 SDS-PAGE电泳等方法鉴定洗脱结果。 （2）咪唑为碱性，相应缓冲液配制后需要用 HCl调节 pH值。 （3）降低 pH洗脱和螯合剂洗脱会使金属离子脱落，下次使用前需重新螯和金属离子。 （4）有条件的可以进行咪唑梯度线性洗脱以确定较佳的洗脱条件。 上述洗脱方法，均须在缓冲液中加入 150～500mmol/L的 NaCl以消除离子交换作用。 3.5 再生 （1）多次使用后或需要更换螯合的金属离子时，必须将凝胶脱镍再生。脱镍方法：首先用 5个柱床体积 20mM PB，0.5M NaCl, 50mM EDTA, pH 7.4溶液淋洗层析柱，然后用 5个柱床体 积的结合缓冲液淋洗层析柱，最后用 5～10个柱床体积的蒸馏水淋洗层析柱。 （2）多次使用的柱子脱镍后一般需要清洗。清洗方法：用 0.1～1.0 mol/L NaOH反向清洗 柱子，50 cm/h保持 1～2 h，不仅可以去除结合强的杂质，也可以去除热源。 （3）清洗后需要重新螯合金属离子。螯合方法：首先用 2～5个柱床体积的蒸馏水充分洗 涤脱镍后的柱子，然后用 0.5倍柱体积的 0.1～0.3mol/L金属盐溶液过柱，接着用 5个柱床体积 的蒸馏水淋洗层析柱，最后用 5个柱床体积的平衡缓冲液平衡柱子。 3.6 在位清洗 当发现层析介质色谱性能下降或反压增加时，应进行清洗。清洗前，请按照推荐的操作步 骤将 Ni2+离子剥离。 脱镍后的层析介质，清洗一般采用反相流速，可使用以下方法清洗： （1）去除因离子交换作用吸附的蛋白：先用 1.5 mol/L NaCl溶液反向清洗 2～3个柱床体积， 然后再用蒸馏水清洗 3～5个柱床体积。 （2）去除沉淀蛋白、疏水性蛋白和脂质等：先用 1.0 mol/L NaOH反向清洗柱子（50 cm/h，碱液接触时间 1～2 h），接触 12h以上可以去除内毒素，然后用 10个柱床体积的平衡缓冲液淋 洗层析柱，最后用 5个柱床体积的蒸馏水淋洗层析柱。 （3）去除疏水性蛋白和脂类：先用 5-10个柱床体积的 30%异丙醇反相清洗层析柱（接触 时间 15-20min），然后用 10个柱床体积的蒸馏水淋洗层析柱。 3.7 存储 密封保存在 4~30℃（保存溶液为 20%乙醇）干燥、通风、清洁处，不可冷冻；用过的柱 子保存在 4~8℃，20%乙醇溶液中。 3.8 运输 运输中避免日晒、雨淋、重压，严禁与有毒、有害物品混运。 4.注意事项 （1）样品与 Ni Seplife® FF（NTA）必须用平衡缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析。 （2）所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。 （3）使用时保证柱子和缓冲液的温度一致，避免柱床内产生气泡，影响纯化效果。 （4）洗脱过程中应严格控制流速，且勿过快。 （5）加样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。