核酸外切酶III能够沿着双链DNA的3'→5'方向逐步切去单核苷酸。每一次的反应只切除最末的几个核苷酸以对双链DNA产生渐进缺失。该酶可以切割双链DNA，产生单链gap，但对单链DNA无活性。通常具有平末端或3'凹陷末端的DNA是最适底物。相反，3'突出末端抗该酶的切割，拮抗程度随3'突出末端的长度而改变，四碱基或更长的突出完全不能被切割。这种特性对于一端是抗性位点（3'突出端）一端是敏感位点（平端或5'突出端）的线性DNA分子，可以产生单向缺失。 另外，与BAL 3 Nuclease相比，本酶的碱基特异性较小，如在富含GC的位置上，由于反应停止的机率较低，可用于DNA的Deletion制作。 本制品是把Exonuclease III基因(E. coli)在大肠杆菌中进行表达后，经多次纯化分离而得到的。