RNAscope® 由美国Bio-Techne旗下ACD公司于2012 年推出，是一项新型的RNA原位杂交技术。它是基于ACD专利的双zz型探针设计，寡核苷酸互补配对的信号放大系统，通过酶催化底物，可在显微镜下看到荧光或可见光的信号。不仅实现了单一分子RNA的原位检测，还可实现在一张组织切片上标记多个不同的RNA分子。根据试剂盒的不同，分为荧光试剂盒和可见光试剂盒。该技术可以应用到多种类型的样本中，如石蜡包埋样本，冰冻样本，贴壁细胞，悬浮细胞样本等。

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RNAscope®技术原理

RNAscope® 独特的双Z (ZZ)探针设计有效的防止了探针的非特异性结合，同时降低了背景干扰。一个标准探针是由20对双Z探针组成，每个Z靶向探针由三部分组成：Z型探针底部是一个18到25碱基长度的序列能够互补结合到目标RNA上。这个序列是基于目标序列的不同，以及独特的结合特征而进行的特异性设计。Z型探针的中部是一个间隔序列，链接了探针的上下两端。Z型探针的顶端是一个14碱基长度的尾部序列。因而一对Z形探针对的顶端序列组合成一段28个碱基长度的结合区以供信号放大前体序列的结合。

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RNAscope®技术的优势

特异性：Z形探针对的设计屏蔽了背景噪音。单独一个Z形探针对即使结合上非目标序列也无法提供信号放大前体序列结合所需要的足够长度，从而防止了对于非特异信号的扩增，保障了特异性；

灵敏度：每三对Z形探针对就足以实现对一个RNA分子的检测。在RNA分子出现部分序列不能被有效暴露或者部分降解等情况下，20对Z形探针对的设计保障了足够强劲有效的检测RNA ；

提供qPCR无法提供的原位信息、形态信息；

单分子量级的可视性与量化分析：此20x20x20x的引物设计与信号放大原理让单一RNA分子能够在标准的显微镜下以一个点状信号的方式可视化呈现；

能够探测到降解的RNA ：得益于其相对短小的目标结合区域(Z形探针对的底端40到50个碱基长度)，此Z形探针对的设计为检测到部分降解的RNA提供了保障；

同时检测多个靶点：可见光双靶点RNA的检测、 3个靶点RNA的荧光检测及RNA和蛋白分子的同步检测。
 

RNAscope®操作步骤

Step 1透化：通过RNAscope®预处理试剂盒处理载玻片上固定好的组织或细胞，以暴露目标RNA。

Step 2杂交：RNAscope®针对靶基因设计的20对Z型目标探针与目标RNA杂交。

Step 3信号放大：RNAscope®检测试剂盒通过信号扩增序列与显色标记有序互补结合，从而扩大信号。

Step 4可视信号形成：在透视光学显微镜或者多光谱成像系统的观测下，每一个目标RNA分子以一个点状信号的形式呈现。

Step 5量化分析：显微镜下，直接计数或者使用HALO自动化图像分析软件，对每一个细胞中的RNA单分子信号进行精确定量分析。

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RNAscope®结果分析

显微镜观察结果并分析

    根据每个细胞中观察到的点状信号评分（定量），评分标准如下图所示：

RNAscope®检测应用

1、肿瘤相关靶标检测

由于全基因组基因表达谱技术的广泛使用，RNA生物标志物或基因表达特征已成为一类主要的癌症生物标志物。目前临床诊断分析中使用的平台是实时RT-PCR，这种方法有一个严重的缺点:RNA提取的过程破坏了基因表达测量的组织背景，使得不可能将观察到的信号映射到单个细胞。此外，这些检测容易受到意想不到的细胞类型(如非癌细胞)和不想要的组织成分(如纤维化和坏死)的干扰。相比之下， RNAscope®允许将分子信息与组织病理学相结合，以获得最佳的临床解释。

RNAscope检测FFPE肿瘤组织中RNA。A:原发肿瘤组织(乳腺、肺和前列腺)的显色染色(DAB)，与泛素C (UBC)探针或细菌基因dapB探针杂交作为阴性对照。细胞核用苏木精反染。B: FFPE样品中低拷贝转录物的荧光检测。乳腺肿瘤组织切片用无探针或Alexa Fluor 488标记探针组(绿色)与HPRT1或POLR2A杂交。细胞核用DAPI反染(蓝色)。[1]

2、分泌型蛋白的检测

一些分泌蛋白，如生长因子、细胞因子等，这些蛋白的IHC检测可能存在缺乏公认的有效的抗体，蛋白结果难以判读等问题，通过RNAscope检测其mRNA的表达可能更易得到有效的检测结果。

3、点突变、可变剪切的检测

对于点突变、可变剪切以及高度同源序列翻译产物的检测，因无法生成有效抗体从而无法在蛋白水平进行原位检测，通过RNAscope来可视化定位是很好的替代方法。

4、RNAscope®检测其他应用

肿瘤生物标志物、肿瘤微环境检测；

免疫与免疫治疗、免疫微环境检测；

神经研究领域Marker、GRCR、神经激活与可塑性研究等；

病毒、病毒与宿主相互作用，如HPV、HIV、AAV、溶瘤病毒等；

干细胞标记与干细胞微环境；

基因治疗、CART安全性评估、TCR-Tcell等多种细胞治疗；

模式生物、小物种相关基因检测等。

RNAscope®服务类型

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百奥动物实验室拥有全套徕卡制片设备、全自动IHC/ISH检测仪器（BOND RX）以及Akoya荧光扫描成像系统——为您提供上述所有RNA原位杂交的一站式检测服务。

RNAscope®试剂周期

参考资料：[1] Wang F，Flanagan J，Su N，Wang LC，Bui S，Nielson A，Wu X，Vo HT，M XJ，Luo Y. RNAscope：一种用于福尔马林固定、石蜡包埋组织的新型原位RNA分析平台。J Mol Diagn. 2012.1;14(1):22-9. doi：10.1016/j. jmoldx. 2011.08.002. PMID: 22166544; PMCID: PMC3338343.