PBMC（人外周血单个核细胞）移植是免疫缺陷小鼠中快速重建人源T细胞的主流方法，相较于耗时较长的CD34+造血干细胞移植，实验周期更短，广泛用于GvHD模型构建、过继性细胞治疗、溶瘤病毒及免疫检查点药物评价等领域。

人PBMC免疫重建方法

小鼠的选择

一般选择5-6周龄，雌性，个体体重差在3g差内。

人PBMC的复苏

37℃预热含10%FBS的RPMI1640完全培养基，4℃冰箱预冷不含10%FBS的RPMI1640培养基。

戴上防爆面罩及防冻手套后，将冻存管从液氮中迅速取出，立即放入37℃水浴锅中解冻。晃动冻存管，直至剩余少许冰晶时取出，此过程约2min。
 

注意：不要让水没过冻存管。

在生物安全柜中打开冻存管，将冻存管中的细胞转移至已加入10 mL预热的完全培养基的离心管中，然后用1mL预热的培养基冲洗冻存管，并将其转移至离心管。

将细胞悬液在4℃条件下，400g离心10min，巴氏管吸弃上清。

加入1mL预冷的不含10%FBS的RPMI1640培养基重悬细胞并混匀，取20μL细胞悬液，用countstar计数仪AO/PI进行细胞计数。

根据计数结果，重悬细胞，调整细胞浓度，转移至2mL的EP管中，置于冰上，准备注射。

注意事项：

① 在操作过程中，如发现死细胞团块，第一时间把死细胞团块用移液枪吸出来，防止死细胞释放的DNA导致细胞成团，影响后续实验；

② 巴氏吸管吸弃上清时，留一点在管底，避免同时把细胞吸走；

③ 细胞计数取细胞悬液时，需要充分混合均匀， 避免影响计数的准确性。

人PBMCs尾静脉注射

用1mL移液器混匀EP管中的细胞悬液，将1 mL注射器的注射针头拔掉换上粗针头（1.2*38 mm），吸取细胞悬液，每次吸取注射2-3只小鼠的细胞量，轻轻震荡排出注射器内的气泡，然后换上注射器原装针头，轻推注射器推杆，直至看到针头处有细胞悬液。

将待注射的动物从笼具内取出，保定在固定器内，使尾巴外露，固定好后检查小鼠，确保小鼠的鼻部露出可正常呼吸。

将小鼠固定器在实验操作台上固定好，确保不会来回移动。

用酒精擦拭尾部血管使其扩张，并可使皮肤角质软化。然后将尾部向左或向右拧90°，使一侧尾静脉朝上，左手拇指和食指捏住尾巴需要进针部位的远心端（尾端） ，右手持注射器，使针头与静脉平行，且针尖截面朝上。从食指平面位置进针，进针约3-5mm，刺入后先缓慢推注少量悬液，如无阻力，表示针头已进入静脉，可继续注入细胞悬液。

注射完毕后用无菌干棉球按住进针位置，拔针，持续按压，直到不出血即可。

将小鼠放回原笼盒，在笼卡上填写注射信息。

注意事项：

① 注射前必须将注射器里的空气排干净；

② 注射时应先少量推注，确定针头在静脉内，再开始注射，如有阻力，不可强推，防止血管破损；

③ 尾静脉注射时要尽量缓慢，不可过快。

在PBMC重建中，实验变量多、重复性差、GvHD是的常见问题。百奥动物通过donor筛选、细胞敏感性分析及接种时间优化，系统性减少变量，助力实验稳定性提升，并基于B-NDG小鼠研发B-NDG B2m KO mice plus、B-NDG MHC I/II DKO mice plus等一些列小鼠，有效改善小鼠PBMC重建后的GvHD，延长实验窗口期。

部分PBMC重建数据展示

构建GvHD模型，比较不同品系小鼠减轻GvHD的效果

对B-NDG、B-NDG B2m KO plus 以及B-NDG MHC I/II DKO plus 小鼠中人 PBMCs 植入诱导的 GvHD 严重程度的比较。

5周龄雌性B-NDG小鼠、B-NDG B2m KO plus 和B-NDG MHC I/II DKO plus 小鼠用1.0 Gy照射，然后在第0天（n=6）静脉植入来自三个健康供体（供体1-3）的人PBMCs（5×106）。用Kaplan-Meier生存曲线分析小鼠的存活率。每周测量两次体重。GvHD的临床症状每周评分两次。结果表明，与B-NDG小鼠或B-NDG B2m KO plus 小鼠相比，B-NDG MHC I/II DKO plus 小鼠中MHC I/II双重敲除可以显著延长人PBMC植入诱导的GvHD的寿命并减轻其严重程度。因此，B-NDG MHC I/II DKO plus 小鼠对于改善移植PBMC后GvHD症状确实优于B-NDG小鼠和B-NDG B2m KO plus小鼠。值表示为平均值±SEM。

人PBMC重建的B-NDG小鼠的体内药效评价

使用人PBMCs重建的B-NDG小鼠建立人结肠癌CDX原位模型，并验证其抗人PD-L1抗体药效。

将人PBMCs （5E6）静脉植入B-NDG小鼠（雌性，7周龄，n=6）。将人结肠癌细胞系B-Tg (Luc) RKO细胞（1E6）原位接种于B-NDG小鼠结肠组织中。在肿瘤接种后3天腹腔注射抗人PD-L1抗体（内部合成）。结果显示，抗人PD-L1抗体在原位结肠癌模型中显著抑制肿瘤生长，表明人PBMCs重建的B-NDG小鼠可成功建立结肠原位肿瘤模型，并验证抗人抗体的体内药效。数值以平均值±SEM表示。

使用人PBMCs重建的B-NDG 小鼠建立NUGC4人胃癌模型，并验证其抗人 CD3/CLDN18.2 双特异性抗体药效 。

将人 PBMCs（5E6）静脉移植入 B-NDG 小鼠（雌性，7 周龄，n=6）。在 PBMCs 移植 7 天后，将人胃癌细胞系 NUGC4（5E6）皮下接种。在肿瘤接种 7 天后，腹腔注射抗人 CD3/CLDN18.2 双特异性抗体（AMG 910，内部研发）。当肿瘤体积达到 50 - 80 mm3且人血 hCD45+细胞百分比≥10%时，将动物分为对照组和治疗组，并开始给药。结果显示，在给药期间，重建的人 CD45+细胞百分比持续增加。抗人 CD3/CLDN18.2 双特异性抗体显示出显著的剂量依赖性肿瘤抑制作用。表明人PBMCs重建的 B-NDG 小鼠可成功建立胃癌模型，并验证双特异性抗体的体内药效。数值以平均值±标准误表示。
 

人PBMC重建的B-NDG B2m KO plus小鼠的体内药效评价

将人PBMCs （1E7）注射到B-NDG B2m KO plus小鼠中，皮下植入人结肠癌RKO细胞（5E6） （n=7/8）。当肿瘤体积达到约100-150 mm3时，将小鼠分组。腹腔注射抗人PD-1抗体（Pembrolizumab）和抗人CTLA4抗体（Ipilimumab）。结果表明，抗hPD -1抗体和抗人CTLA4抗体联合使用可有效抑制肿瘤生长，说明人PBMC重建的B-NDG B2m KO plus小鼠为体内抗体评价提供了强有力的临床前模型。数值以平均值±SEM表示。

将人PBMCs （5E6）植入B-NDG B2m KO plus小鼠（雌性，9周龄，n=6）后，皮下植入人RKO细胞（5E6）。当肿瘤大小约为100 mm3时，将动物分为对照组和治疗组。结果表明：抗PD-1×PD-L1双特异性抗体有明显的抑瘤作用，说明人PBMC重建的B-NDG B2m KO plus小鼠为体内抗体评价提供了一个强有力的临床前模型。数值以平均值±SEM表示。

人PBMC重建的B-NDG MHC I/II DKO小鼠的体内药效评价

使用人PBMC重建的B-NDG MHC I/II DKO mice plus建立NCI-N87人胃癌模型，并验证抗hCD3/hHER2双特异性抗体的药效。

将人胃癌细胞系NCI-N87（1×107）皮下接种于B-NDG MHC I/II DKO plus小鼠。接种细胞系3天后，将人PBMCs（1×107）静脉植入B-NDG MHC I/II DKO plus 小鼠（雌性，6-9周龄，n=6）。肿瘤接种后3天，腹腔注射抗hCD3/hHER2 BsAb类似物（内部合成）和抗hHER2抗体曲妥珠单抗类似物（内部合成）。当肿瘤体积达到100mm3时，将动物分为对照组和治疗组。结果显示，抗hCD3/hHER2双特异性抗体有明显的抑瘤作用，说明人PBMC重建的B-NDG MHC I/II DKO plus小鼠为体内抗体评价提供了一个强有力的临床前模型。数值以平均值±SEM表示。