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DiI是用于标记细胞膜的荧光探针，DiA，DiI，DiO，DiD和DiR染料是用于标记细胞膜和其他疏水结构的亲脂荧光染料家族。当掺入膜中或与亲脂性生物分子如蛋白质结合时，这些对环境敏感的染料的荧光大大增强，尽管它们在水中是弱荧光的。它们具有高消光系数，极性依赖性荧光和短激发态寿命。一旦应用于细胞，这些染料在细胞质膜内横向扩散，导致整个细胞在其浓度下均匀染色。 DiI（橙色荧光），DiO（绿色荧光），DiD（红色荧光）和DiR（深红色荧光）的独特荧光颜色为活细胞的多色成像和流式细胞分析提供了便利的工具。 DiO和DiI可分别与标准FITC和TRITC过滤器一起使用。
| Di系列染料 | 特点 |
| DiO染料（绿色） | 活细胞或固定细胞、组织的的长期示踪剂。荧光强度低于DiI。对某些固定组织的染色效果一般。 |
| DiA染料（绿色） | 一种细胞膜绿色荧光染料，它在细胞膜中的扩散速度比 DiO 快，并且经常和 DiI 一起使用于细胞膜双色标记。可以进行染色后的固定。DiA 对固定细胞的染色效果比 DiO 好。 |
| DiI染料（橙色） | 活细胞或固定细胞、组织的的长期示踪剂。除标记细胞膜外，还可以检测细胞的融合和粘附、细胞迁移等。 |
| DiB染料（橘色） | 一种检测细胞膜电位的亲脂性阴离子荧光染料，它本身无荧光，当进人细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光。当它进入细胞后，指示细胞内荧光强度增加，即膜电位增加表示细胞去极化；反之，若细胞内荧光强度降低，即膜电位降低表示细胞超极化。 |
| DiD染料（红色） | 染色效率高，均一，不易猝灭，细胞毒性低，背景干扰小。 |
| DiS染料（红色） | 一种细胞膜红色荧光染料，它在细胞膜中的扩散速度比 DiD快，可以进行染色后的固定。DiS 对固定细胞的染色效果比 DiD好。 |
| DiR染料（深红色） | 常用于标记细胞膜，红外荧光可以穿透细胞和组织，在活体成像中用来示踪。DiR可以进行染色后的固定。 |
选择建议：DiI, DiO, DiD 和 DiR均可染色活细胞或固定细胞及组织（请您根据您的需求选择相应的探针），DiI比DiO荧光更亮；DiD，DiR波长更长，更适合组织染色
实验方案（仅供参考）
样本分析
1.制备DiO，DiI DiD，DiS或DiR膜染色溶液：
1.1制备DMSO或EtOH储备溶液：储备溶液应在DMSO或EtOH中以1-5mM制备。
注意：储备溶液的未使用部分应储存在-20℃。 避免反复冻/融循环。
1.2准备工作溶液：将储备溶液稀释到合适的缓冲液中，如无血清培养基，HBSS或PBS，制成1至5uM的工作溶液。
注意：对于不同的细胞类型和/或实验条件，应根据经验确定工作溶液的浓度。
2.将细胞染成悬浮液：
2.1在染料工作溶液中悬浮细胞密度为1×106/ mL。
2.2在37℃孵育2-20分钟。培养时间取决于细胞类型。 首先孵育20分钟，然后根据需要进行优化以获得均匀的标记。
2.3将标记的悬浮管以1000至1500rpm离心5分钟。
2.4去除上清液，轻轻地将细胞重新悬浮在预热（37℃）的生长培养基中。
2.5按步骤2.3和2.4洗涤两次。
3.染色贴壁细胞：
3.1在无菌玻璃盖玻片上培养贴壁细胞。
3.2从生长培养基中取出盖玻片，轻轻地排出多余的培养基。 将盖玻片放在湿度箱中。
3.3将100μL染料工作溶液吸移到盖玻片的角落，轻轻搅拌直至所有细胞都被覆盖。
3.4将盖玻片在37℃孵育2-20分钟。 培养时间根据细胞类型而变化。开始孵育20分钟，然后根据需要进行优化以获得均匀的标记。
3.5排出染料工作溶液，用生长培养基清洗盖玻片两到三次。 对于每个洗涤循环，用预热的生长培养基覆盖细胞，孵育5-10分钟，然后排出培养基。
注：流式细胞仪检测：用DiO，DiI，DiD，DiS和DiR标记的细胞可分别使用常规FL1，FL2，FL3和FL4流式细胞仪检测通道进行分析。
