Hifair® Ⅲ One Step RT-qPCR Probe Kit是以RNA为模板进行定量PCR反应的试剂盒。在实验的过程中，逆转录和定量PCR在同一反应管中进行，简化了实验操作，降低了污染的风险。本试剂盒以RNA为模板，使用基因特异性引物，利用耐热Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase高效合成第一链cDNA，并搭配使用探针和UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase，配合优化的缓冲体系能够特异灵敏的对RNA模板进行精确定量。

本试剂盒以预混的Mix形式提供，2×Hifair® Ⅲ P buffer包含优化的缓冲体系和dNTPs等，优化了有效抑制非特异性 PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子，适用于荧光标记探针的高特异性检测系统。此外，Hifair® UH Ⅲ Enzymes包含比例优化的Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase、RNase inhibitor及UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase等。

产品组分

【注】P buffer 为Probe buffer 的简写，UH 为UNICON-Hifair 的简写。

适用机型

High Rox 适用机型：ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™

Low Rox 适用机型：ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 and 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex

Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™

不需要 Rox 校正的仪器型号：

Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon® 2, Chromo4™

Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000

Roche Applied Science LightCycler® 480, LightCycler® 2.0; Lightcycler® 96

Thermo Scientific PikoReal Cycler; Cepheid SmartCycler®; Illumina Eco qPCR

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃避光保存，有效期1年。本品避免反复冻融。建议分装保存。

注意事项

1. 实验过程中请使用 RNase free 耗材。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

反应体系（以 20 μL为例）

【注】:

a 所有试剂使用前应充分混匀。

b 参比染料：Rox的添加，可根据不同仪器型号进行选择，具体可参考【适用机型】。

c 引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。

d 探针浓度：探针终浓度可在50 nM-250 nM之间调整。

e 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染 。

f 模板稀释：一步法RT-qPCR灵敏度极高，推荐将模板稀释后(如稀释至2-5 μL/样本)加入反应体系中，这样可以有效提高实验的重复性 。

g 反应体系：建议以大体系进行实验，如20 μL或50 μL 。

标准扩增程序

【注】:

a 对于含复杂二级结构或高GC含量的RNA模板，可将逆转录温度提高到55℃，有助于提升扩增效率和灵敏度。

b 逆转录时间可以根据模板的复杂程度进行调整，时间为5min时可满足大多数基因的鉴定。

c 不同的qPCR检测仪器所需的荧光信号采集时间不同，请根据最短时间限制进行设置。

HB220304