产品简介

本试剂盒提供了核酸等温扩增所需的试剂，具有高度敏感性、强特异性等特点。前期操作时间短，反应温度（37-42 °C）容易满足，20分钟内即可完成指数级的扩增。适用RNA模板，最低检测下限10-100拷贝/反应。

产品规格

保存条件

干冰运输，请注意避免反复冻融。长期储存放置-80 ℃，有效期1年。

稳定性

-20 ℃放置14天，试剂活性无显著降低（数据更新中）；

冻融5次，试剂活性无显著降低；

4 ℃下放置3天，试剂活性无显著降低；

冻干后，扩增时间略微推迟，灵敏度不变；

质量控制

核酸内切酶活性

50 μL反应体系中包含10 μL反应体系mix与500 ng环状质粒DNA，37 ℃下温育4 h后，使用琼脂糖凝胶电泳检测核酸内切酶活性。

RNA水解酶活性

50 μL反应体系中包含10 μL应体系mix与500 ng单链RNA，37 ℃温育4 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测试剂中RNA水解酶活性。

宿主DNA残留

以大肠杆菌16S rDNA为靶标，采用荧光定量PCR法检测试剂中宿主DNA残留量。

实验流程

参考体系

1. 按体系处方加入RNA扩增预混液（荧光型）、Buffer P（该试剂较粘稠，请确保粘附于枪头内壁的试剂全部打出）、引物和探针，并充分震荡均匀（此步骤显著影响扩增效率，建议涡旋震荡仪震荡20-30次，每次1-2 s），分装于PCR反应管中。

2. 加入模板，在每个反应管的盖子上加入2 μL激活剂，合盖离心后再混合-离心1次；

3. 于PCR仪中42 °C孵育20分钟，每隔30 s采集一次荧光。

其他

RT-EMA荧光探针设计原则：

在上下游引物中间，设计一段长度为46-52 nt与目的片段互补的序列作为荧光探针；探针序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-52 nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。探针共有四个修饰位点：

1. 距离5’端的30-35 nt的中部位置标记一个dSpacer（四氢呋喃，THF），作为核酸外切酶的识别位点（任何碱基，无特殊要求）；

2. THF位点的上游的T碱基上标记一个荧光基团（如FAM），下游在T碱基上标记一个淬灭基团（如BHQ1），两个基团的间距为 2-4 nt；

3. THF距离3’末端约15 nt，并且3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或C3-spacer。

目标扩增区域及引物的设计原则

目标扩增应长于70 bp但不超过500 bp，最好是150-250 bp左右，该范围效果最佳；

目标扩增区域的碱基分布应相对均匀，GC含量在40%~60%之间，相邻和相近位置含相同碱基的频率低，尽量不含正/反向重复和回文序列。

引物长度一般在30-35个核苷酸左右，最长一般不超过42个核苷酸；

引物5’端前3-5个核苷酸应避免连续的碱基G，而碱基C/T则有利于核酸扩增；

引物的3’末端的最后3个核苷酸出现碱基G/C有利于扩增；

引物的筛选

等温扩增引物的设计对扩增效率影响较大，若对引物要求较高，可对其进行多步筛选，引物设计可按照右图进行。

引物筛选基本流程

任选一条正向引物分别与候选反向引物搭配反应，选定最佳的反向引物；

用最佳反向引物分别与候选正向引物搭配反应，选定最佳的正向引物；

筛选与验证条件

筛选时的反应条件不使用最佳参数，可降低模板拷贝数、缩短反应时间；

引物浓度可在150 nM-600 nM之间优化；

引物筛选可直接使用琼脂糖凝胶观察是否能扩增出目的片段。