1、原代 
（1）取材后的组织放在预冷的（2-8°C）组织保存液的取样瓶中，快速转运至洁净实验室进行组织处理和细胞分离，拍照并登记信息。
（2）准备若干培养皿，加入 4℃预冷的人正常肠类器官组织原代培养缓冲液备用。
（3）取样瓶消毒，将组织放入培养皿中，利用人正常肠类器官组织原代培养缓冲液清洗三次后，利用眼科剪或手术刀将组织剪切成体积约为 1-3mm3的组织块。
（4）组织用人正常肠原代组织消化液消化，37℃震荡消化10-20min，（消化过程中随时观察消化情况）。
（5）取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的单个细胞或 70um 以下的细胞簇后，加入三倍体积人正常肠类器官组织原代培养缓冲液终止消化。
（6）使用100um孔径的筛网进行过滤，将滤液收集后，于300g富集离心5min后移去上清，添加人正常肠类器官组织原代培养缓冲液重新重悬离心。
（7）基质胶计算：第6步后观察收集到的组织体积，添加25倍组织体积的基质胶重悬铺板。
（8）24孔细胞培养板为例，每孔点胶25ul组织基质胶混合物进行铺板（4℃下操作）。
（9）将铺好的培养板放入37℃培养箱中10-15min成胶，添加人正常肠类器官培养基（恢复室温）进行培养。
2、类器官传代培养
（1）移液枪吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃类器官传代培养缓冲液放置2min。
（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，4℃静置10min。（每6-8孔为一组）
（3）a：类器官数量不足或体积较小时： 离心5min弃去上清，添加适量人正常肠类器官传代培养缓冲液重悬移入1.5ml离心管，300g离心5min弃去液体进行第4步。
         b：类器官数量较多或体积较大时：离心5min弃去上清，添加适量类器官传代消化液消化2-3min，添加人正常肠类器官传代培养缓冲液终止消化，离心5min弃去混合液，添加适量人正常肠类器官传代培养缓冲液重悬移入1.5ml离心管，300g离心5min弃去液体进行第4步。
（4）类器官收集后，添加基质胶重悬，每孔25ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15min添加500ul人正常肠类器官培养基。
3、类器官冻存
（1）移液枪吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃类器官传代培养缓冲液放置2min。
（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，4℃静置10min。（每6-8孔为一组）
（3）离心5min弃去上清，添加适量人正常肠类器官传代培养缓冲液再次重悬，300g离心5min弃去液体。
（4）添加适量类器官冻存液，轻柔吹打重悬，以24孔细胞培养板为例：密度为2个孔冻存1管，每管体积1.4ml。
（5）做好标记信息，进行程序降温后，移入液氮长期保存。
4、类器官复苏
（1）取10ml人正常肠类器官传代培养缓冲液于15ml离心管中。
（2）从液氮罐中取出冻存的类器官细胞，快速置于 37℃水浴锅中融解。
（3）水浴融解过程中，需轻轻摇动冷冻管，以确保冻存液在 1-2min内完全融解。
（4）将溶解后的类器官细胞快速转移至15ml 离心管，使用移液管轻轻吹打6-8次，300g 离心 5min，然后除去上清液并收集类器官细胞沉淀。添加适量人正常肠类器官传代培养缓冲液重悬移入1.5ml离心管300g离心5min。
（5）基质胶重悬，每孔25ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15min成胶，添加500ul人正常肠类器官培养基。