基因敲入是实现基因稳定过表达的一种有效工具。稳定细胞系在重组蛋白制备、抗体制备、药物筛选、基因功能研究及其它方面起着重要作用。稳定细胞系能持续生长，并持续稳定表达外来基因。根据研究或应用方向，可通过改变插入的拷贝数及启动子活性，调控外源基因在靶细胞的表达水平，使其升高、降低、或与靶细胞内源基因表达量相等。外源基因的插入方式可分为随机插入，或插入定点位置。

粒曼采用自主开发的定点基因敲入(gene knock in) pCargo-Harbor平台将目的基因插入到HEK293细胞的AAVS1安全港位点。该方法优于基于慢病毒和转座子系统的基因敲入，实现在细胞安全港AAVS1位点定点单拷贝插入目的基因，该插入位点为转录活性位点且不影响其他基因的功能，而且产生的细胞基因型一致，表达均一，遗传稳定。

粒曼HEK293 Harbor过表达稳定细胞系构建的优势

1. 基因型单一:产生的细胞基因型一致，表达均一，遗传稳定;
2. 定点插入:在细胞安全港AAVS1位点定点插入目的基因;
3. 操作简单，周期短：相比于慢病毒和转座子系统获得表达单一的稳定细胞周期更短。

粒曼HEK293 Harbor过表达稳定细胞系构建的流程

1. 载体构建：将目的基因构建至粒曼特有的稳转质粒系统pCargo载体中。（周期1周）

2. 细胞转染：采用转染试剂转染的方式，将pCargo质粒递呈至HEK293 Harbor细胞内，利用粒曼开发的定点重组技术在HEK293 Harbor细胞中将带有强启动子EF1a调控的目的基因定点单拷贝整合至HEK293细胞基因组安全港位点上。（周期1周）

3. 抗性筛选：稳定定点整合的pCargo质粒会使细胞获得puro抗性，使用puromycin(1ug/ml)将转染后的细胞中整合上目的基因的细胞筛选出来，未整合目的基因的细胞无puro抗性而被puromycin杀死。（周期2-3周）

4. 蛋白表达验证：收取抗性筛选完成的细胞沉淀，进行Western blot检测（周期1周）或质谱分析（周期2周），保证目的基因正常表达。

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