概述

描述：细胞凋亡是指为维持有机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。正常情况下任何细胞在形成过程中发生的异常都会通过凋亡消除。Annexin V染色的细胞可以用于检测细胞凋亡早期的细胞膜变化。在细胞凋亡早期,磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞的胞膜特异性结合，因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。用荧光素标记的Annexin V通过流式细胞仪或荧光显微镜可以检测到细胞凋亡的发生。7-氨基放线菌素(7-AAD)是一种核酸染料，同PI有着相似的荧光特性，但其发射光谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品。7-AAD只能透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜，因此将Annexin V和7-AAD联合使用，就可将凋亡早期、晚期及坏死细胞区分开来。
应用范围：FC

产品组分

在上述条件下，可稳定保存2年
 

实验范例

人外周血PBMC细胞(A) 未处理 (B) 55°C水浴处理15min 按照说明书操作流程进行染色，用流式细胞仪检测结果。

操作流程

1. 根据实验要求，诱导细胞凋亡。

2. 离心收集细胞（300g 离心 5min，弃上清），用预冷的 PBS 清洗两次。对于贴壁细胞，先用不含 EDTA 的胰酶消化收集（胰酶消化时间不宜过长），再用预冷的 PBS 清洗两次。

3. 用 9ml 去离子水稀释 1ml 10×Binding Buffer，配置成 10ml 1×Binding Buffer。

4. 用 1×Binding Buffer 重悬细胞，使细胞的密度达到 1×106 个 /ml。

5. 取 100µl 细胞悬液（1×105 个）至流式管或 EP 管中。

6. 每管加入 5µl Annexin V-FITC 和 5µl 7-AAD，轻轻混匀。在室温（25℃）下避光孵育 15min。

7. 每管加入 200~400µl 1×Binding Buffer 轻轻混匀，样本应在 1 小时内完成上机检测。

注：10×Binding Buffer 需用去离子水稀释成 1× 后再使用。染色时，不可用 PBS 替代 Binding Buffer。

流式细胞仪检测

1. FITC激发波长 Ex =494nm；发射波长 Em =519nm 7-AAD激发波长 Ex =543nm；发射波长 Em =647nm

2. Annexin V-FITC的绿色荧光通过FL1通道检测； 7-AAD的红色荧光通过FL3通道检测。

3. 除实验组外，还应合理设置对照组用于仪器参数的调节。（例如通道电压、荧光补偿等）

对照设置（仅供参考）

1. 使用预冷PBS缓冲液清洗细胞两次，再用1×Binding Buffer缓冲液制成1×106个/ml的细胞悬液。

2. 各实验管中加入100ul细胞悬液，分别按下表中的细胞处理方法处理细胞，再加入对应试剂避光孵育15分钟。

3. 孵育结束后，各实验管中加入1×Binding Buffer缓冲液200~400ul轻轻混匀。一小时内上流式细胞仪测定结果。

常见问题

1. Annexin V 试剂盒能否用于贴壁细胞？

可以。但是需要注意以下几点，

①尽量使用不含 EDTA 的胰酶进行消化。如果用含 EDTA 的胰 酶，终止消化后用 PBS 将细胞清洗干净，去除 EDTA 残留。处理细胞过程中操作要轻柔，胰酶消化时间要适宜。

②比较难消化的细胞，可以采取分批次消化，或使用温和的消化液（如 Accutase）消化细胞。

③诱导凋亡时出现的漂浮细胞也要收集，与后续收集的贴壁细胞一并进行上机检测。

2. Annexin V-FITC/7-AAD 试剂盒需要调补偿吗？

需要。建议制备单染管，使单染管细胞的阳性信号与阴性信号有明显差异，便于补偿调节。

3. 细胞含有 GFP 荧光蛋白怎么办？

此时不建议使用 FITC 标记的 Annexin V 试剂盒（FITC 与 GFP 的发射光谱重叠），死活染料也不建议使用 PI（因为 GFP 荧光蛋白有时表达水平较高，和 PI 一起使用容易补偿过大，调节困难） 。推荐使用 Annexin V-APC/7-AAD 试剂盒。

4. 为什么要在染色后 1h 内上机检测？

核酸染料 PI 或 7-AAD 对细胞有一定毒性，长时间作用会对细胞活性不利（凋亡阳性率上升）。

5. 样品制备有哪些关键的细节？

①PBS 需要预冷

②避免用力吹打细胞

③染色时使用试剂盒配套的 Binding Buffer

④避免贴壁细胞胰酶消化时间过长

⑤尽量避免使用含 EDTA 的胰酶，或充分清洗去除 EDTA

6. 为什么检测不到凋亡阳性信号？

①染色时没有使用 Binding Buffer

②胰酶中的 EDTA 残留没有清洗干净

③死活染料染色后进行了清洗，正常操作是不清洗直接上机

④细胞的初始活性差

⑤药物处理剂量不足或处理时间不够

⑥药物本身不会诱导细胞凋亡

⑦诱导凋亡时出现的漂浮细胞没有收集

⑧试剂盒荧光选择不对

7. 流式测凋亡为何左上象限比例出奇的高？

左上象限一般是由于处理方式不当（机械力过大），处理时间太久或刺激物质浓度过高导致的环境骤变引起的非凋亡途径的细胞死亡 , 需要优化处理的浓度和时间梯度，以及优化细胞培养和细胞消化的流程。